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原代海马神经元细胞培养常规的试剂配制及试验操作过程分享

  • 分类:知识学堂
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  • 来源:专业提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB细胞库源细胞、动物实验、CRO服务、SCI润色)
  • 发布时间:2022-01-13 10:41
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【概要描述】原代培养的海马组织由多种细胞构成,如成纤维细胞、胶质细胞等,成分复杂,因此原代培养过程中细胞纯化是关键的一步。本人主要采取以下措施来达到细胞纯化

原代海马神经元细胞培养常规的试剂配制及试验操作过程分享

【概要描述】原代培养的海马组织由多种细胞构成,如成纤维细胞、胶质细胞等,成分复杂,因此原代培养过程中细胞纯化是关键的一步。本人主要采取以下措施来达到细胞纯化

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  一、常规的试剂配制:
  1、培养基:选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉(含15 mmol Hepes),每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g,调节pH值7.0,0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后,加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液,使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml,分装后置于4℃保存,临用前加入2%的B27。神经细胞代谢旺盛,选用高糖型培养基;谷胱甘肽可保持培养基还原状态,营养成分稳定;B27是公认的刺激神经元生长的营养因子,不过价格挺贵;PH值很关键,Hepes是优秀的缓冲系统,pH值调好后能保持很长时间;
  2、多聚赖氨酸溶液的配制: 称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS,0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,密封后置于4 ℃保存,可长期使用;
  3、磷酸盐缓冲液(PBS)的配制: 称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4?12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O,调节pH值为7.2,补dd H2O至1000 ml并分装,高压灭菌(121~126 ℃),4 ℃备用;
  4、D-Hanks液的配制:称取KCl 0.4 g,KH2PO4 0.06 g,NaCl 8.0 g,NaHCO3 0.35 g,Na2HPO4?12H2O 0.08 g,溶于dd H2O中,调节PH值为7.2,定容至1000 ml,高压蒸汽灭菌(121~126 ℃),4℃备用;
  5、0.25%胰蛋白酶的配制:称取0.25 g胰蛋白酶粉末,少许D-Hanks溶液调成糊状,用D-Hanks定容至100 ml,混匀,冰箱内放置过夜,滤纸过滤后,0.22 mm微孔滤膜过滤,分装,-20 ℃保存。
  二、试验操作过程:
  1、包被:培养前晚上将培养瓶(板)用多聚赖氨酸包被10 min,吸除,无菌操作台上15min自然晾干,置于培养箱中备用;
  2、取脑:选取新生24 h的SD大鼠数只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,断头处死,无菌条件下分层剪开头皮、颅骨,用弯镊拉开脑区视野,小心取出全脑,D-hanks液洗数次;(预先准备至少4把眼科剪刀,分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作)
  3、分离:以脑中线为起点,小心拨开大脑颞叶皮层,暴露出新月状海马回,小心夹出海马组织,置于冰浴的D-hanks液中,仔细剔除微血管,用充分剪碎组织;
  4、消化:加入同体积0.125%的胰蛋白酶,瓶口用锡箔纸盖上,37 ℃培养箱内消化20 min左右,期间轻摇数次;
  过滤:加入数滴胎牛血清终止消化,用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟,至液体成米糊状即停止吹打,动作要轻柔,用150目网筛过滤,收集细胞悬液;
  5、接种:以1100 rpm离心5 min,倾去上清,用DMEM/F12培养液重悬细胞,轻轻吹打,台盼蓝染色快速计数,根据计数结果,调整细胞终浓度为1 00000个/ml,加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶(板)中,置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养;12小时内禁止晃动
  6、换液:接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液,第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞的过度生长,随后每3 d半量换液。
  此外,原代培养的HT22小鼠海马神经元细胞系组织由多种细胞构成,如成纤维细胞、胶质细胞等,成分复杂,因此原代培养过程中细胞纯化是关键的一步。本人主要采取以下措施来达到细胞纯化:
  (1)海马组织取材时组织定位准确,由于海马游离于大脑皮层,这一点容易做到;
  (2)消化前,细心剔除微血管;
  (3)过滤时选择150-200目筛网,尽量使培养的细胞呈单个或数个成团;
  (4)接种24 h时需全量换培养基,除去未贴壁的死细胞;
  (5)接种48 h时加一定浓度的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞(胶质细胞和少许成纤维细胞)的过度生长。

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