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C8-D1A小鼠脑星形细胞要怎么培养?实验具体操作步骤是什么?要注意什么?

  • 分类:知识学堂
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  • 来源:专业提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB细胞库源细胞、动物实验、CRO服务、SCI润色)
  • 发布时间:2022-01-21 10:55
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【概要描述】将小鼠处死后浸泡入体积分数75% 乙醇中消毒,以血管钳从后夹住颈部,用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨,再用眼科镊依次剥离,剔除脑膜及血管。取大脑(剔除海马部分)置于1 × PBS (pH 7.4 )中,漂洗去表层血丝,至脑组织呈乳白色

C8-D1A小鼠脑星形细胞要怎么培养?实验具体操作步骤是什么?要注意什么?

【概要描述】将小鼠处死后浸泡入体积分数75% 乙醇中消毒,以血管钳从后夹住颈部,用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨,再用眼科镊依次剥离,剔除脑膜及血管。取大脑(剔除海马部分)置于1 × PBS (pH 7.4 )中,漂洗去表层血丝,至脑组织呈乳白色

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详情

  正常C8-D1A小鼠脑星形细胞培养
  一、实验试剂
  1、培养基: PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
  2、冻存液: PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
  3、洗涤液: 1 × PBS (pH 7.4 )+ 1% P/S
  4、染色液: 0.4% Trypan Blue
  5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit
  6、检测试剂:抗小鼠CD 11b/c抗体,荧光标记二抗,乙醇丙酮混合液(1:1)
  二、实验器械
  1、培养皿
  2、培养瓶
  3、直剪和眼科剪
  4、眼科镊和止血钳
  5、10ml注射器
  6、玻璃滴管
  7、烧杯
  8、15ml离心管
  三、实验流程
  取材
  ↓
  去除大脑脑膜及血管,剔除海马部分
  ↓
  1 × PBS (pH 7.4 )漂洗3次,去掉表层血丝
  ↓
  先用眼科镊将组织撕碎成糜状,用眼科剪反复剪10min,再用移液器轻轻吹打20~30次。
  ↓
  将组织转移至15ml离心管中,加入消化液(PriCells)
  ↓
  将离心管放置到37℃,15-20min水浴恒温消化
  ↓
  加入消化终止液(PriCells)终止反应
  ↓
  离心,1000rmp,10min,弃去上清
  ↓
  重悬,计数细胞
  ↓
  接种密度以1 × 106 个/ml
  ↓
  培养37℃,5%CO2
  四、实验 操作
  1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶,置于超静台吹干或45℃烘箱烘干(切记保持无菌),4℃冰箱放置,备用。
  2、取材:正常昆明小鼠(生后24h内)。
  3、材料预处理:将小鼠处死后浸泡入体积分数75% 乙醇中消毒,以血管钳从后夹住颈部,用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨,再用眼科镊依次剥离,剔除脑膜及血管。取大脑(剔除海马部分)置于1 × PBS (pH 7.4 )中,漂洗去表层血丝,至脑组织呈乳白色。
  4、消化液:用眼科镊将组织撕碎成糜状,再用眼科剪反复剪10min,最后再用移液枪轻轻吹打20~30次,将剪碎的组织用枪转移至15ml离心管中,37℃水浴消化15min。
  5、终止消化:按1:1加入消化终止液,中止酶反应。
  6、收集重悬细胞:1000 rpm,离心10 min,弃去上清,加入培养液重悬,染色计数细胞。
  7、培养细胞密度:调整细胞密度以1 × 106 个/ml 接种入培养瓶。
  8、培养:放置于37℃,5% CO2 培养箱中。
  五、细胞鉴定
  1、显微鉴定:相差显微镜下,可见细胞呈星形状,细胞密度增高后呈现鹅卵石样镶嵌排列,有接触抑制的特点。细胞具备良好的透光性。
  2、免疫组织化学鉴定 :利用OX-42 (CD 11b/c)免疫荧光染色。
  3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中,接种细胞为3×104 个/孔,48小时候细胞可以长满,用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。
  4、细胞固定:用PBS洗涤细胞,之后放入乙醇丙酮混合液中,固定10min,空气中自然干燥。
  5、特异性抗体:按照说明书稀释比要求稀释抗体,加入抗体,放置37℃孵育60min。
  6、洗涤:1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次 × 15 分钟,晾干。
  7、标记性抗体:加入荧光标记抗体,37℃孵育30min。
  洗涤:1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次 × 15 分钟,晾干。
  8、封片:封片剂封片。
  9、镜检:荧光显微镜下观察,胶质细胞包质呈现较强黄绿色荧光,细胞核周围尤其明显。
  六、注意事项
  1、选材注意选取新生昆明小鼠(24h内)。取材过程尽可能保证无菌,尽量剔除脑膜及血管和海马部分。
  2、注意尽可能消除脑组织表面的残血,避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。
  3、胶质细胞分离损伤严重影响胶质细胞的生长,因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。
  4、严格控制胶质细胞培养条件。包括细胞培养用液(培养基,生长因子,血清,抗生素)的质量,浓度。
  5、关于培养瓶包被与否,有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中,可以酌情考虑是否包被。
  6、传代培养细胞接种量为1×106 个(25 cm2 培养瓶),细胞倍增时间为36小时。细胞传代培养最佳为5-8代, 传代次数增加,细胞体积增大,细胞之间间隙增加,细胞贴壁牢固,传代消化时间会有所延长。

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