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小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)详细到第个步骤注意事项,请收下

  • 分类:知识学堂
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  • 来源:专业提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB细胞库源细胞、动物实验、CRO服务、SCI润色)
  • 发布时间:2022-02-11 15:12
  • 访问量:

【概要描述】取小鼠股骨胫骨,小鼠要年轻!(6W-8W,以前用只一年左右的养出来外形也张牙舞爪,但流式检测没有CD11c表达,很奇怪啊;性别方面公母不限,经典版本说公的好,公的壮实,骨头大)

小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)详细到第个步骤注意事项,请收下

【概要描述】取小鼠股骨胫骨,小鼠要年轻!(6W-8W,以前用只一年左右的养出来外形也张牙舞爪,但流式检测没有CD11c表达,很奇怪啊;性别方面公母不限,经典版本说公的好,公的壮实,骨头大)

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  1. 取小鼠股骨胫骨,小鼠要年轻!(6W-8W,以前用只一年左右的养出来外形也张牙舞爪,但流式检测没有CD11c表达,很奇怪啊;性别方面公母不限,经典版本说公的好,公的壮实,骨头大)。
  2. 冲骨髓细胞,冲出来的骨髓细胞永远没有文献上说的那样多,但不影响大局,一次用两只,怕出意外少了细胞,不要混一起。
  3. 细胞计数,不去红细胞!(不知是好是坏,文献说去红细胞会把一些祖细胞也去掉了)记数,计数只记白细胞(形态学区分,红细胞无核较小),2×10e6(似乎太低,这套方案作者是一皿养到第12天的,所以个人觉得看在哪天收细胞做下游实验,如果只养到第6天或者第8天,多点应该也行吧?)白细胞种100 mm细菌培养皿(注意是细菌培养皿,说悬浮细胞还是用细菌皿好,还说抑制细胞贴壁,让更多祖细胞向树突细胞分化而不是巨噬细胞),这一天记为第0天。
  4. 第3天加等体积(10 ml)BMDC培养基
  配方:每50 ml含:1640基础培养基45 ml,5 ml灭活胎牛血清,50 ul 100×的β-巯基乙醇(一直不知道它的作用,请高手跳出来作答谢谢啊),500 ul 100×的谷氨酸盐,1 ug rmGM-CSF(Chemicon和PPT的都用过,现在用PPT,好像还行)。
  5. 第6天,第8天半量换液,离心设置为300 g,5min(不知道够不够,肯定有损失)。
  6. 第10天300 g,5min收集悬浮细胞转到细胞培养皿(巨噬细胞多贴点壁),同时培养基成分里rmGM-CSF含量至少减半。
  7. 第11天加LPS刺激其成熟,普遍认为,第6天或第8天收不成熟DC会比较多,看实验需要,建议想要不成熟DC的朋友请在这两天收网。
  一般做到第5步就上流式,也就是6到8天的BMDC, CD11c表达波动在50-80%,偶尔做CD86,成熟标志吧?15%左右。具体流式结果和光镜形态照片过几天(或几周)发上来大家一起探讨。MHC2没有做(技术员说实验室流式机器做APC的有关部件有故障,MHC2抗体正好带APC)。还发现用PE标记和FITC标记的CD11c流式抗体检测CD11c表达发现阳性细胞数(还是表达量)相差1倍(同一批细胞分两管,分开操作,抗体剂量不同,都过量了,都洗了两遍,一个公司的抗体,25%和50%)。
  总结:
  1. 培养100%纯的DC几乎是不可能,一般达到85%就不错了,在收集细胞是只要吹打不要太猛,巨噬细胞一般是不会悬浮起来的。
  2. 有时也几只小鼠的骨髓细胞混养,但只要是同系(如:都是C57)的,问题不大。
  3. 如果取自不同系的小鼠如Balb/c和C57的骨髓细胞混养就不可避免地产生混合淋巴细胞培养。
  4. 骨髓细胞中有淋巴细胞,两个个体的细胞混合会产生“混合淋巴细胞培养”反应,导致淋巴细胞大量增殖

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