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正常人角膜上皮细胞培养步骤及实验的具体方法分享

  • 分类:知识学堂
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  • 来源:专业提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB细胞库源细胞、动物实验、CRO服务、SCI润色)
  • 发布时间:2022-02-17 16:51
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【概要描述】将供体角膜放于消毒过的容器上,上皮面朝上,用手术刀切成12个三角形组织片。应一刀切下,避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原基质的破坏和成纤维细胞的脱落

正常人角膜上皮细胞培养步骤及实验的具体方法分享

【概要描述】将供体角膜放于消毒过的容器上,上皮面朝上,用手术刀切成12个三角形组织片。应一刀切下,避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原基质的破坏和成纤维细胞的脱落

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  1. 正常人角膜移植供体角膜(推荐阅读:HCECs人角膜上皮细胞
  2. 胰蛋白酶/EDTA液:0.05%胰蛋白酶,0.5mmol/L EDTA
  3. KGM:无血清角质形成细胞培养液,添加0.15mmol/L 钙、0.1ng/ml 人上皮生长因子、5mg/ml 胰岛素、0.5mg/ml 氢化可的松和30mg/ml 牛垂体提取物;MEM;PBSA;胎牛血清
  4. FNC:10mg/ml 纤连蛋白、35ug/ml 胶原蛋白和100mg/ml BSA(bovine serum albumin)。BSA作为稳定剂
  5. 6孔培养板:用鼠尾Ⅰ型胶原蛋白涂培养板底壁
  6. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素,pH7.4
  7. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪,眼科镊
  8. 离心管(15ml、50ml)
  实验方法:
  1. 将供体角膜放于消毒过的容器上,上皮面朝上,用手术刀切成12个三角形组织片。应一刀切下,避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原基质的破坏和成纤维细胞的脱落。
  2. 将角膜组织片的上皮面朝向下,放入用鼠尾Ⅰ型胶原蛋白预处理的6孔培养板,每孔放4个组织块。
  3. 用镊子轻压组织片,以便使组织块与培养皿表面充分接触。将组织片放置20min,使其变干。
  4. 将一滴KGM轻轻滴于组织片上,在37℃和5%CO2 条件下孵育过夜。尽管从眼库得到的供体角膜是用抗菌素的培养液保存的,但全部操作应在无菌条件下进行。
  5. 第2d,在培养皿中加入1ml培养液。在培养早期,可观察到细胞仅从角膜缘处迁出,但没有细胞从角膜或虹膜迁出。无血清培养液含有低浓度钙离子(0.15mmol/L),减少胶原基质降解,故这种培养液可减少成纤维细胞长出。
  6. 在植入角膜组织片后第5d,用镊子将组织片取出,再加入3ml培养液。取出组织片后,贴壁细胞继续增值。第2周,细胞生长形成单层,呈现上皮具有的典型卵石状排列特征。每个角膜约获得6×106 个上皮细胞。每周换液2次。
  7. 扩增培养:取出组织片后,当细胞融合达70%-80%时,用PBS浸洗细胞。然后,在37℃条件下用胰蛋白酶-EDTA液处理4min。用含有10%FBS的PBS终止消化。将细胞离心后,用KGM混悬。计数细胞,以1×104个/cm2密度将细胞接种于涂有FNC的培养皿。在37℃、5%CO2 条件下培养。1d后换培养液。

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