研究背景与目的
　　乙型肝炎病毒CHepatitis B virus, HBV)感染是一个重大的公共卫生问题，全世界约有2.48亿人感染HB V，其慢性感染可导致一系列严重的肝脏疾病，包括肝纤维化(fiver fibrosis，肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝细胞癌C hepatocellular carcinoma , HCC。HB V具有种属特异性和组织特异性，同时还具有高复制和高突变率特性，其常见的基因突变位点为基础核心启动子(Basic Core Promoter，BCP)区的1762 C A1762T)和1764 C G1764A)及前核心(Pre-Core }  PC)区的1896 C G1896A)和1899 C G1899A。体外实验或临床样本研究已发现，B CP/PC联合突变会阻断或降低HBeAg表达，然而，B CP/PC联合突变对HB V表型的更多影响尚未报道。本实验在前期B CP/PC联合突变  C B CP/PC C M)乙肝小鼠模型的基础上，建立回复突变(B CP/PC C R)慢性乙型HBV小鼠模型，通过对比分析研究B CP/PC联合突变对HB V主要标志物表型、机体免疫表型的影响，为临床诊断和探讨B CP/PC联合突变所致的表型变化机制提供了理论依据。

　　前言
　　慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的世界上最常见的慢性传染病之一，可最终导致肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝细胞癌(hepatocellular carcinonma, HCC ) }1-3}。尽管己有最新的基因工程HB V疫苗和多种抗HB V药物的开发和应用，但HBV感染仍然是全球主要的健康问题之一，全世界大约有2.48亿慢性HB V感染患者[[4]0
　　HB V感染机体后，其基因组由松弛环状DNA (relaxed circular DNA, rcDNA)修饰成共价闭合环状DNA ( Covalently closed circular DNA, cccDNA)的形式存在于感染肝细胞的细胞核中，cccDNA的持续存在是HB V不能完全消除以及停药后复发的主要原因f5-81。从肝细胞中消除cccDNA被认为是消除慢性HB V病毒感染的
　　终极目标[m。应用免疫健全、能表达ccc DNA、且HB sAg能持续表达6个月的小鼠模型，是进行HB V相关研究的理想模型。
　　HB V具有高复制和高突变率的特性。最常见的HB V基因组变异包括基本核心启动子(Basic core promoter, BCP)区ntA1762T/G 1764A双突变和前核心(Pre-core, PC)区ntG 1896A/ntG 1899A的终止密码子突变。目前己知B CP/PC突变可分别阻断或降低HBeAg的表达「lo-lay }  BCP/PC突变与野生型两者在CHB的发病机
　　理，免疫力，自然临床过程，预后和治疗方面存在重大差异[[13' 14]。有研究发现BCP/PC突变会显着增加了CHB患者发生HCC的风险[[15];也有研究表明感染BCP/PC突变病毒的CHB患者比感染BCP/PC野生型病毒的患者更容易发生重度肝炎和肝功能衰竭，感染PC突变病毒的肝功能衰竭患者死亡风险也更高「16]。在之
　　前的研究中，我们课题组从临床患者血清中分离并鉴定出BCP/PC  (  ntA1762T/G 1764A/G 1896A/G 1899A)联合突变、B基因型和adw血清亚型的HB V毒株[ys}。以此毒株DNA为模板在体外合成cccDN A，通过尾静脉高压注射(hydrodynamic injection, HDI)方法建立了一个模拟HBeAg阴性的C_57BL/6J和CB A/C aJ小鼠模型「17' 18]。然而，这种自然BCP/PC突变毒株除HBeAg缺陷外，对HB V其它表型是否有影响仍不清楚。由于HB V的表型特性对于评估CHB患者的疾病进展和治疗反应至关重要「‘”]。因此，在本研究中，我们分别以BCP/PC突变基因序列(BCP/}C CM)和回复BCP/PC突变位点后的基因序列(BCP/PC CR)
　　为模板，制备并鉴定了BCP/PC CM ) cccDNA和BCP/PC CR ) cccDNA。然后将不同的cccDNA HDI到CBA/CaJ小鼠中，同时建立BCP/PC (M)和BCP/PC (R)的HB V动物模型。通过对比分析的方法，精确动态的观察天然BCP/PC突变对HB V的表型影响。
　　方法
　　1.应用分子生物学方法制备BCP/PC C R)共价闭合环状DNAC covalently closed circular DNA, cccDNA，并测序鉴定。
　　2.在HepG2细胞中转染BCP/PC CM ) cccDNA和B CP/PC C RcccDNA,   ELISA实验检测HB sAg和HBeAg的分泌水平。
　　3.通过尾静脉高压注射的方法将两种HBV cccDNA和/或生理盐水分别注射到CBA/CaJ雄性小鼠C 8-10 w)体内，于指定时间点采取血清样本和小鼠肝脏组织样本。
　　4.通过放射免疫法检测血清样本中HB sAg和HBeAg的水平。
　　5.通过qPCR检测小鼠血清和/或肝脏组织中HB V DNA和cccDNA的水平。
　　6.通过免疫组化检测肝脏中HB sAg和HBcAg的蛋白质水平。
　　7.通过RT qPCR检测肝脏中IL-1p，IL-4, IL-6和IL-10的mRNA水平。
　　8.通过HE染色检测肝脏病理变化。
　　9.通过统计学方法分析肝脏和血清中HB V标志物的相关性。
　　结果
　　1.酶切及测序结果表明B CP/PC C R )  cccDNA构建成功。
　　2.在HepG2细胞中分别转染BCP/PC CM) cccDNA和B CP/PC  C R ) cccDNA o B CP/PC C M ) cccDNA转染后，细胞培养液上清中未检测到HBeAg，且HB sAg的水平明显低于BCP/PC CM)组(p<0.05 > o
　　3. CBA/CaJ小鼠分别注射BCP/PC CM ) cccDNA和B CP/PC C RcccDNA后，两种小鼠中HB V标志物(HBsAg, HBeAg, HBV DNA和cccDNA)均可持续表达26周以上。
　　4.在感染早期，BCP/PC CM)组小鼠血清中HB sAg和HB V DNA的水平以及肝脏中HB V DNA和cccDNA的水平均显著低于B CP/PCCR)组(p<0.05;在整个感染期，BCP/PC CM)组小鼠血清中ALT的水平明显高于BCP/PC CR)组(p<0.05。与BCP/PC C R)组相比，感染4周后，B CP/PC C M)组肝脏中IL-4和IL-10的mRNA水平显著
　　降低;然而，感染26周后，B CP/PC C M)组肝脏中IL-4和IL-10的mRNA水平显著升高，IL-1p的mRNA水平显著降低。
　　5.感染26周后，两组小鼠肝脏均出现炎性细胞浸润现象，且B CP/PC C M)组的炎性细胞浸润少于BCP/PC C R)组。
　　6.在两组小鼠中，血清中HB V DNA的水平与肝细胞内HB V DNA和cccDNA的水平均呈显著正相关。
　　结论
　　1.成功回复突变构建了B CP/PC C R ) cccDNA，并建立了B CP/PCCM)和BCP/pC CR)慢性乙型肝炎小鼠模型。B CP/PC C R)组小鼠血清HBeAg的表达持续阳性，两组小鼠中的HB V标志物均能稳定表达26w以上。
　　2. BCP/PC突变导致小鼠感染早期血清及肝脏中HB V标志物水平降低，以及整个感染周期血清中ALT水平升高。
　　3.血清中HB V DNA水平比HB sAg更好地反映肝细胞内HBV复制程度和cccDNA拷贝数。
　　4. BCP/PC突变导致小鼠感染后期炎症反应减轻，其机制可能是在感染早期，B CP/PC突变抑制小鼠肝脏中Th2细胞因子的表达，而在感染后期，抑制Thl细胞因子的表达。
　　关键词:B CP/PC突变，表型，慢性乙型肝炎，小鼠模型，共价闭合环状DNA