目的
　　1.应用高压水尾静脉注射HBV复制小鼠模型，系统比对分析急、慢性HBV感染模型中特异性免疫应答特点差异。
　　2.应用土拨鼠WHV感染模型，研究土拨鼠T细胞抑制性受体分子Tim-3及其配体Gal-9 (Galectin-9)分子特点及其在WHV不同感染状态下分子表达特点。
　　方法
　　1.应用高压水注射pSM2, pAAV/HBV 1.2质粒分别建立急性自限性HBV小鼠模型(Acute-resolving mouse, ARM)和慢性HBV肝内复制小鼠模型(Persistent replication mouse, PRM);ELISA (Enzyme linked immunosorbentassay)检测ARM和PRM血清中病毒标志物HBsAg, HBeAg表达水平;FAC S(Fluorescence-activated cell sorting)检测质粒注射后不同时I旬点ARM和PRM外周和肝脏中:
　　①主要特异性免疫应答细胞频率的动态变化及差异;
　　②CDB+T, CD4+ T细胞表面活化及抑制性受体分子表达的动态变化及差异;
　　③APC细胞(Antigen presenting cell)表型动态变化特点及差异;④肝内HBV特异性T细胞内因子IFN-y, TNF-a和IL-2的分泌。
　　2.应用土拨鼠模型，克隆Tim-3和Gal-9分子并分析其分子特点，应用RT-qPCR(Reverse Transcription Real Time Quantitative Polymerase China Reaction)检测其组织表达，以及Gal-9分子在WHV不同感染状态下的表达情况;制备土拨鼠Tim-3分子多克隆抗体，并应用WB (Western blot)和FACS (Fluorescenceactivated cell sorting)鉴定其功能。
　　结果
　　一、急、慢性HBV复制小鼠中特异性免疫细胞频率动态变化及比对分析:
　　1.CDB+T细胞:HBV质粒注射后第4天(4dpi, 4 days post injection)在ARM和PRM中均增多，7dpi在ARM外周血中增多，21 dpi在ARM肝脏中增多，而PRM中则没有此现象;
　　2.HBV特异性CDB+ T细胞:4-7即i在ARM中增多，21 dpi在ARM肝脏中增多，而PRM中则没有此现象
　　3.DC细胞(Dendritic cells )4即i在ARM脾脏中增多，7dpi在ARM外周血中增多，14dpi在ARM肝脏中增多，而PRM中则没有此现象;
　　4.CD4+T细胞:4即i在ARM和PRM脾脏中增多5.B细胞:21 dpi在ARM外周血中特异性增多;)MC细胞(Myeloidcells ) :21 dpi在PRM肝内特异性增高;
　　二、急、慢性HBV复制小鼠中CD4+和CDB+ T细胞活化表型的动态变化及比对分析:
　　1.CDB+ T细胞活化表型:ARM小鼠脾脏、外周血及肝脏中CDB+ T细胞活化表型CD44表达较PRM增高，抑制性表型CD62L表达较PRM降低;
　　2.CD4+ T细胞活化表型:ARM脾脏、外周血及肝脏中CD4十T细胞活化表型CD44表达较PRM增高，抑制性表型CD62L表达较PRM降低。
　　三、CD8十T细胞功能检测:HI后21 dpi ARM肝内HBV抗原特异性CDB+ T细胞分泌细胞因子的能力较PRM增强。
　　四、急、慢性HBV复制小鼠中APC细胞(Antigen presenting cells)表面分子PD-L1(Programmed death ligand 1)、MHCI (Major Histocompatibility Complex I)动态变化及比对分析:
　　1.DC细胞MHCI表达:21 dpi在ARM肝脏中增多;
　　2.MC细胞MHCI表达:14dpi在ARM脾脏中增多;14dpi在PRM肝脏中增多，21 dpi在ARM小鼠肝脏中增多;
　　3.PD-L 1:  DC细胞PD-L 1表达:7dpi在PRM脾脏中增多;21 dpi在PRM肝脏中增多;
　　4.MC细胞PD-L 1表达:21 dpi在PRM脾脏中增多;21 dpi在ARM肝脏中增多;
　　五、获得土拨鼠Tim-3分子576bp胞外段序列，Gal-9分子全长CDS区序列，相似性比对分析发现土拨鼠Tim-3 , Gal-9分子与地松鼠相似性最高，其氨基酸水平相似性分比为97%和98%;
　　六、Tim-3分子mRNA在土拨鼠各器官组织中表达由高到底依次为大肠、脾、肺、心脏、小肠、脂肪、翠丸，而肌肉、肾脏与肝脏中未检测到;Gal-9分子mRNA在土拨鼠各器官组织中高到底依次为翠丸、’肾、肝脏、大肠、心脏、肌肉、脾脏、小肠、脂肪、肾脏;
　　七、Gal-9分子mRNA在WHV慢性感染土拨鼠肝脏组织中表达升高，而在急性感染土拨鼠肝组织中表达降低;
　　八、制备兔抗土拨鼠Tim-3多克隆抗体，1:500效价用来WB (Western Blot)检测土拨鼠Tim-3分子的表达;1:50效价可用来流式检测土拨鼠PBMC细胞( Peripheral blood mononuclear cells)中Tim-3分子的表达。
　　结论
　　1.急、慢性HBV复制小鼠中特异性免疫的主要免疫细胞频率存在差异:
　　①ARM和PRM早期脾脏中均存在CDB+ T细胞的致敏增殖，但PRM外周致敏的T细胞不能被募集至肝脏发挥抗病毒效应;
　　②HBV抗原特异性CD8+T细胞仅在ARM肝脏中增殖，而PRM肝脏中无病毒特异性T细胞聚集;
　　③ARM中DC细胞早期在脾脏中增殖，随之在外周血中升高，后期肝脏内升高的现象，而PRM中无此现象，提示PRM中DC细胞增殖能力差。
　　2.急、慢性HBV复制小鼠中T细胞活化表型及功能存在差异:
　　①ARM脾脏、外周血和肝脏中T细胞表面受体分子表达与PRM相比，活化性受体表达升高，抑制性受体表达降低，提示PRM中T细胞活化障碍;
　　②ARM肝内HBV特异性CDB+ T细胞杀伤功能较PRM明显增强。
　　3.急、慢性HBV复制小鼠中APC细胞表面分子表达存在差异:PRM肝内DC细胞感染后期表达PD-L 1升高，提示PRM中可能存在DC细胞功能耗竭;
　　4.获得土拨鼠Tim-3部分胞外段以及Gal-9全长编码序列。
　　5.  Tim-3分子在土拨鼠大肠组织中表达最高，罕丸组织中最低;Gal-9分子在各组织器官中表达广泛，其在寒丸组织中表达最高，在肾脏组织中最低;
　　6.土拨鼠不同WHV感染状态下Gal-9的表达情况存在差异。
　　7.成功制备了Tim-3胞外段多兔抗土拨鼠多克隆抗体，该抗体有较高的效价和特异性，能够用于WB和FACS的检测。
　　本研究的创新点和意义
　　1.首次利用小鼠HBV复制模型，系统比对分析了HBV急、慢性复制过程中，外周及肝内特异性免疫免疫应答特征的差异，包括特异性免疫细胞的频率、T细胞及APC细胞活化/抑制表型、T细胞功能的动态变化;
　　研究首次发现在HBV慢性复制小鼠中，也存在早期外周免疫器官(脾脏)中CDB+ T细胞的致敏增殖，但增殖的细胞不能同ARM中一样，能够被有效募集至肝脏发挥抗病毒作用，为CDB+ T细胞在清除HBV感染中作用的研究提供新的线索。
　　本研究首次克隆土拨鼠Tim-3和Gal-9分子序列，同时检测了Tim-3和Gal-9分子在土拨鼠不同组织中表达情况以及不同 WHV感染状态下Gal-9分子的表达情况并进行分析。
　　首次制备抗土拨鼠Tim-3多克隆抗体，可以用来检测Tim-3蛋白在的表达。
　　关键词:乙肝病毒、异性免疫应答、小鼠高压水HBV模型、土拨鼠WHV感染模型、Tim-3分子、Gal-9分子