研究背景与目的
　　靶向T细胞抑制性检测点肿瘤免疫治疗是当今生物医学研究的最热点。研究表明，利用单抗药物直接作用于PD-1可以有效地阻断抑制性免疫检测点，激活T细胞，增强T细胞的功能，达到治疗肿瘤的目的。在机体的免疫系统中，肠道由于接触抗原的表面积最大并且免疫细胞数量较多，因而被认为是体内最大的免疫器官I1，发生于结直肠的恶性肿瘤与免疫逃逸有关。本研究利用CRISPR/Cas9技术对T细胞PD-1基因进行靶向敲除，采用小鼠结肠癌模型进行PD-1基因敲除的T细胞的体内抗肿瘤作用及其可能机制研究，采用非人灵长类动物食蟹猴作为实验动物，高度模拟PD-1基因敲除T细胞在体内的安全性评价，以期建立利用CRISPR/Cas9技术靶向T细胞PD-1基因进行肿瘤细胞免疫治疗的策略，进而为临床研究的实施奠定坚实的实验基础。（推荐阅读：T84人结直肠癌细胞、LIM1215人结直肠癌细胞、SW837人直肠癌细胞、DIFI人结直肠癌细胞）
　　【方法】
　　在GENEBANK 数据库中查找获得小鼠PD-1基因序列，设计靶向小鼠PD-1基因的sgRNA，构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体，经扩增、酶切鉴定及测序验证，获得正确的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体。分离获得小鼠外周血PBMC，富集细胞数量为1x107，加入敲除PD-1基因的PX458敲除载体5μg，采用Lonza-4D电转仪进行电转染，48h后检测转染效率，采用PCR技术和T7E1 酶切验证PD-1基因的敲除。体外培养结直肠癌细胞株CT-26，分为∶阴性对照组∶CT-26细胞组、PD-1基因敲除T细胞组，实验组∶CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组，CT-26与未经PD-1基因敲除的T细胞及PD-1单抗共培养组。绘制各组细胞生长曲线，细胞杀伤检测试剂盒检测PD-1基因敲除的T细胞的杀伤能力，通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例的变化及体外分泌细胞因子的水平变化。
　　【结果】
　　成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA，构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体，建立小鼠PD-1基因敲除T细胞，对其体外特性进行检测，结果显示∶流式细胞仪检测PD-1基因敲除T细胞CD3、CD4、CD8比例无明显变化；PD-1基因敲除T细胞与结直肠癌细胞株CT-26在不同效靶比作用下体外抑制肿瘤效应结果显示∶各组细胞生长曲线示∶与其他两组相比，CT-26 与PD-1基因敲除T细胞共培养组，CT-26与未经PD-1基因敲除T细胞及PD-1 单抗共培养组，72小时细胞活率明显下降，与其他两组相比，CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组，CT-26与PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组，与肿瘤细胞共培养后∶IFN-y、TNF-α、IL-2的水平增加。【结论】
　　建立了稳定的体外定向敲除T细胞抑制性免疫检测点PD-1的技术，获得了小鼠同种异体PD-1基因敲除T细胞，体外实验显示，可抑制肿瘤细胞的生长，为体内抗肿瘤的研究奠定了基础。
　　【关键词】
　　CT-26，sgRNA，CRISPR/Cas9，体外研究；