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PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内 安全性评价的临床前研究

  • 分类:学术讲座
  • 作者:吉妮欧
  • 来源:专业提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB细胞库源细胞、动物实验、CRO服务、SCI润色)
  • 发布时间:2022-04-20 15:23
  • 访问量:

【概要描述】成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体,建立小鼠PD-1基因敲除T细胞,对其体外特性进行检测

PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内 安全性评价的临床前研究

【概要描述】成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体,建立小鼠PD-1基因敲除T细胞,对其体外特性进行检测

  • 分类:学术讲座
  • 作者:吉妮欧
  • 来源:专业提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB细胞库源细胞、动物实验、CRO服务、SCI润色)
  • 发布时间:2022-04-20 15:23
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  研究背景与目的
  靶向T细胞抑制性检测点肿瘤免疫治疗是当今生物医学研究的最热点。研究表明,利用单抗药物直接作用于PD-1可以有效地阻断抑制性免疫检测点,激活T细胞,增强T细胞的功能,达到治疗肿瘤的目的。在机体的免疫系统中,肠道由于接触抗原的表面积最大并且免疫细胞数量较多,因而被认为是体内最大的免疫器官I1,发生于结直肠的恶性肿瘤与免疫逃逸有关。本研究利用CRISPR/Cas9技术对T细胞PD-1基因进行靶向敲除,采用小鼠结肠癌模型进行PD-1基因敲除的T细胞的体内抗肿瘤作用及其可能机制研究,采用非人灵长类动物食蟹猴作为实验动物,高度模拟PD-1基因敲除T细胞在体内的安全性评价,以期建立利用CRISPR/Cas9技术靶向T细胞PD-1基因进行肿瘤细胞免疫治疗的策略,进而为临床研究的实施奠定坚实的实验基础。(推荐阅读:T84人结直肠癌细胞LIM1215人结直肠癌细胞SW837人直肠癌细胞DIFI人结直肠癌细胞
  【方法】
  在GENEBANK 数据库中查找获得小鼠PD-1基因序列,设计靶向小鼠PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体。分离获得小鼠外周血PBMC,富集细胞数量为1x107,加入敲除PD-1基因的PX458敲除载体5μg,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术和T7E1 酶切验证PD-1基因的敲除。体外培养结直肠癌细胞株CT-26,分为∶阴性对照组∶CT-26细胞组、PD-1基因敲除T细胞组,实验组∶CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除的T细胞及PD-1单抗共培养组。绘制各组细胞生长曲线,细胞杀伤检测试剂盒检测PD-1基因敲除的T细胞的杀伤能力,通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例的变化及体外分泌细胞因子的水平变化。
  【结果】
  成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体,建立小鼠PD-1基因敲除T细胞,对其体外特性进行检测,结果显示∶流式细胞仪检测PD-1基因敲除T细胞CD3、CD4、CD8比例无明显变化;PD-1基因敲除T细胞与结直肠癌细胞株CT-26在不同效靶比作用下体外抑制肿瘤效应结果显示∶各组细胞生长曲线示∶与其他两组相比,CT-26 与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除T细胞及PD-1 单抗共培养组,72小时细胞活率明显下降,与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,与肿瘤细胞共培养后∶IFN-y、TNF-α、IL-2的水平增加。【结论】
  建立了稳定的体外定向敲除T细胞抑制性免疫检测点PD-1的技术,获得了小鼠同种异体PD-1基因敲除T细胞,体外实验显示,可抑制肿瘤细胞的生长,为体内抗肿瘤的研究奠定了基础。
  【关键词】
  CT-26,sgRNA,CRISPR/Cas9,体外研究;

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