关键词
　　大鼠肿瘤动物模型,肿瘤模型,大鼠动物模型,癌症免疫治疗,癌症疫苗,水凝胶,生物材料,个性化肿瘤疫苗模型,个性化精准治疗
　　简介
　　结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）为全球上第三大最普遍的癌症，其发病率和死亡率在全球不断上升。除了人口老化及高收入国家的生活饮食外，肥胖、缺乏日常锻炼及吸烟等不良好因素发生的概率将能够增加结直肠癌的患病机率。病理生理学的发展提升了一部分及晚期疾病的治疗抉择，加强了个体化治疗的发展。结直肠癌的经典治疗模式通常为手术、化疗及放射疗法，这些方法可以用来联合治疗患者。然而，这类治疗手段存在着很多的负作用，因为它们针对于正常细胞增长及分裂存在着较大的细胞毒性。此外，许多患者经过多层次治疗，依旧会面临着肿瘤再次复发的风险。所以，寻找高效的替代治疗方法对于治疗结肠癌患者至关重要。
　　免疫疗法是癌症治疗的新选择之一。免疫疗法的策略是利用病人自身的免疫系统来对抗癌细胞。一些癌症免疫治疗的结果在某些情况下是惊人的，但是一些依赖于患者自身免疫系统状态的情况病人则并非如此。那些对癌症免疫治疗反应良好的患者有更好的预后和生活质量。癌症治疗正迅速进入免疫治疗时代，癌症疫苗被认为是最有前途的癌症免疫治疗方法。然而，目前抗癌疫苗研究的进展仍然有限和缓慢，部分原因是在确定和获得肿瘤特异性抗原方面的困难。考虑到在大多数情况下手术是肿瘤治疗的首选，我们是否可以直接从切除的肿瘤中提取抗原用于设计个体化的肿瘤疫苗基于可注射凝胶材料的术后疫苗局部免疫疗法，成为肿瘤切除术后免疫治疗的一种新型策略和途径，主要包括可注射水凝胶和原位形成的水凝胶等方式。近年来的研究表明，该治疗方式具有易于装载、可降解和控制缓释特性，表现出重要的治疗力。这类部分免疫治疗可能够出现周身抗肿瘤免疫功效，或者达成治疗的功效。
　　对于这一路径，因此，我们设计了一种基于可注射凝胶的肿瘤疫苗（DCHVax），用于肿瘤手术后的个性化治疗。以切除肿瘤的蛋白质为抗原，CpG/聚乙烯亚胺复合物为佐剂，以多臂聚乙二醇（8-arm PEG-NHz）/氧化葡聚糖（ODEX）动态交联水凝胶为基质。DCHVax的皮下注射原位招募树突状细胞，并诱发其强大的肿瘤特异性免疫反应。我们的结果显示，它能有效地抑制小鼠肿瘤模型术后残留肿瘤的生长。这种简单而个性化的癌症疫苗开发方法有望成为临床相关的癌症术后治疗方案。
　　目的
　　利用外科医生在结直肠癌手术中直接接触肿瘤的条件，创建一类对于可注射凝胶的肿瘤疫苗（DCHVax）能够适用在发展期结直肠癌术后免疫治疗，用以处理结直肠癌医疗之后复发的疑惑。
　　方法
　　（1）研制空白可注射动态共价水凝胶∶用不等量质量比的8-arm PEG-NH及ODEX交联，经过醛基和氨基的席夫碱反应（Schiff base reaction）组合成交联网格的水凝胶，并依次检测不同类别质量比研制的可注射动态共价水凝胶强度及粘结性，依照检测成果挑选出最优的质量比
　　（2）可注射动态共价水凝胶的现状∶检测出最好质量比情形之下研制的水凝胶基于体内及体外的溶解情形；
　　（3）含有模型抗原的动态共价水凝胶疫苗（DCHVax）的制备∶将模型抗原 OVA 以及佐剂（CpG/PEI）担载到可注射动态共价水凝胶中，并测试其缓释效果
　　（4）肿瘤中抗原蛋白的提取当肿瘤体积达到200mm?左右时，从小鼠体内切除 MC38或 CT26肿瘤细胞，制备出抗原，用 BCA 法测定蛋白质抗原的含量，定量备用
　　（5）动态共价水凝胶疫苗（DCHVax）的制备将佐剂（CpG/PEI）和肿瘤中提取的抗原蛋白担载到可注射动态共价水凝胶中，并测试其缓释效果
　　（6）动态共价水凝胶疫苗（DCHVax）杀灭残留肿瘤效果的验证∶构建BALB/c小白鼠和C57BL/6小黑鼠皮下结肠癌CT26、MC38细胞不完全切除肿瘤模型，术中将DCHVax注射到小鼠腋下淋巴结处，检测同时保存残留肿瘤增长形式；同时研究注射后第3天及第10天留存的肿瘤免疫细微生长环境的变化；
　　（7）动态共价水凝胶疫苗（DCHVax）治疗之后的肿瘤特殊性免疫记忆效应的检验∶皮下未全部根除肿瘤模型里面通过DCHVax 治疗的小鼠，检验同时记载肿瘤增长形式同时研究系统性免疫细微生存状态（血液及脾脏）的变化
　　结果
　　（1）当8-am PEG-NH与ODEX的质量比为11时，交联形成的可注射动态共价水凝胶同时存在很强的强度及优异的系统粘结性基于身体外，能够注射动态共价水凝胶溶解时间是18天基于身体里面，这种溶解时间超过18天；
　　（2）模型抗原B16-OVA装载及验证，CT26/MC38抗原蛋白被成功提取，并与佐剂（CpG/PEI）被成功装载到可注射动态共价水凝胶中制成肿瘤疫苗DCHVax，并且能够随着DCHVax的降解而同步释放，抗原蛋白和佐剂CpG/PEI的释放时间均达到18天；
　　（3）在皮下不完全切除肿瘤模型中，术中将DCHVax注射到小鼠腋下淋巴结处，显著抑制了肿瘤的再生长。残留肿瘤免疫微环境分析结果显示∶在术之后治疗第3天，本来存在的免疫被快速激活，自然杀伤细胞（Nature killer cells，NK 细胞）的浸润提升，树突状细胞（Dendritic cells，DCs）的活化显著提升，之后适应环境性能免疫能够被激活，肿瘤里面T细胞浸润数目明显提升（第6天）
　　（4）皮下不完全切除肿瘤模型中，搭载OVA模型抗原制备而成的DCHVax-OVA，在对不同分组的B16-OVA小鼠模型进行治疗发现，经DCHVax-OVA治疗后结果显示∶血液及脾脏内记忆T细胞数量显著增多
　　（5）皮下不完全切除肿瘤模型中，搭载我们从肿瘤组织中提取的MC38模型抗原制备而成的DCHVax-MC38，在对不同分组的MC38 小鼠模型进行治疗发现，经DCHVax-MC38治疗后监测并记录肿瘤生长情况全身系统性免疫分析结果显示∶血液及脾脏内记忆T细胞数量显著增多
　　（6）为此我们进行了多种肿瘤模型的验证，在皮下不完全切除肿瘤模型中，术中将DCHVax-CT26注射到小鼠腋下淋巴结处，同样显著抑制了CT26肿瘤的再生长。
　　结论
　　在这项研究中，我们提出了一种用于术后肿瘤治疗的 DCHVax 个性化癌症疫苗平台。我们的研究结果严格证实了DCHVax平台能有效地抑制肿瘤术后复发，显著延长小鼠存活时间。与目前报道的个性化癌症疫苗方法相比，这个平台简单、高效、经济有效，而且普遍适用。因此，我们认为DCHVax平台对于肿瘤术后治疗，特别是晚期肿瘤的临床应用具有重要意义。