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教您实验原理及步骤 关于慢病毒感染细胞教程详细讲解

  • 分类:知识学堂
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  • 来源:
  • 发布时间:2021-12-13 10:33
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【概要描述】慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞

教您实验原理及步骤 关于慢病毒感染细胞教程详细讲解

【概要描述】慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞

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  1. 实验原理
  慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
  所以,在体外实验及体内实验的研究中,慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一,并且正在获得越来越广泛的应用。
  2. 主要材料
  细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂
  3. 主要试剂配制
  (1)PBS磷酸盐缓冲液:PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL,调pH7.2,121℃,30min,高压灭菌,4℃保存备用。
  (2)细胞生长培养液:临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清,再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL,置于4℃冰箱保存。
  4.  实验步骤
  (1)胰酶消化细胞,无血清培养基重悬,调整细胞密度为0.5~1×105/ml(根据情况酌情调整),每孔200ul细胞悬液接种至24孔板,培养箱培养过夜。次日进行慢病毒感染,此时细胞的融合度约为70%左右。
  (2)准备病毒:取出4℃保存的病毒,使用瞬时离心机离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可);如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量,将其稀释到培养基中,并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积,以期获得最佳的感染效率。
  (3)根据预实验确认MOI=100进行后续试验,准确计算好每孔所需病毒原液量。慢病毒使用量=MOI*细胞数目/慢病毒滴度,吸取病毒液加入细胞中,同时加入5ug/mL的Polybrene助转染试剂,以提高感染效率。
  注:感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大,所以务必保证加病毒之前,细胞处于良好的生长状态。
  (4)混匀后将24孔板放在37℃度培养箱中孵育。
  (5)8-12小时以后观察细胞状态。细胞状态与未感染组无明显差异,表明慢病毒对细胞没有明显毒性作用,继续培养,24小时后更换为新鲜培养基。
  (6)感染48小时后,荧光显微镜观察荧光表达情况,估计慢病毒感染目的细胞的效率。同时,收集样本进行后续实验检测。
  Lentivirus 表达时间较长,但在一般代谢较旺盛的细胞(如293T,BHK21等)上,病毒感染24h后可以观察到GFP 荧光;代谢比较缓慢的细胞(如原代培养细胞,神经干细胞,胚胎干细胞等)GFP 蛋白表达时间较长,感染后72-96h甚至更长时间才可以观察到GFP荧光。感染后的细胞可以连续培养一周,通过观察GFP的表达时间和表达强度来确定Lentivirus 对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液和传代,以保证细胞良好的生长状态。
  5. 实验结果100X

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